Рибозими

Печат
Посещения: 4589

За да бъде ензим, една биологична молекула трябва да има няколко свойства: трябва да може да свързва субстрат, да провежда химична реакция, да освобождава продукта и да остава непроменена, като запазва способността си да извършва процеса многократно. РНК, които, подобно на белтъците, могат да приемат много различни пространствени конформации, също могат да изпълняват функцията на биокатализатори.

 

Рибозимите имат активен център, свързващо място за субстрат, кофактор (например метален йон). Каталитичните свойства на РНК са били описани в няколко биологични процеса като РНК сплайсинг, РНК-процесинг, репликация на РНК-геном и формиране на пептидна връзка при транслация.

Природните рибозими (с изключение на рибозомата) катализират реакциите на разкъсване на фосфодиестерни връзки при РНК и последващо свързване (лигиране). За разлика от останалите познати рибонуклеази, рибозимите катализират високо специфични по отношение на нуклеотидната последователност реакции, детерминирани от РНК-РНК взаимодействия между рибозима и неговия субстрат. Способността на рибозимите да инактивират специфично други РНК молекули ги прави удобни инструменти в МБ и потенциални генни супресори с важно приложение.

Повечето природни рибозими (с изключение на Rnase P) катализират вътрешномолекулни реакции в собствените си структури.

Провеждат се многобройни изследвания, които целят да установят способността на рибозимите да инактивират клетъчни или вирусни РНКи. По този начин може да се докаже ролята на рибозимите като генни супресори и потенциалното им приложение за получаване на терапевтични агенти.

Видовете рибозими включват: „self-splicing” интрони; RNaseP; малки каталитични РНКи.

„Self-splicing” интроните се разделят на две групи (­­I и II) в зависимост от техния механизъм на сплайсинг и вторичната им структура. Rnase P е убиквитинов ензим, участващ при синтезата на тРНК. Малките каталитични РНКи включват 4 различни мотива с каталитични функции – “hammerhead”, “hairpin”; HDV (хепатит делта вирус); US – рибозими.

Автокаталитичен сплайсинг (селф-сплайсинг) на пре-мРНК

Извършва се с участието на автокаталитични интрони от група I и група II. Под автокаталитичен сплайсинг се разбира процеса, при който в рамките на пре-РНК интроните придобиват специфична конформация и катализират собственото си изрязване от тази РНК. В условия in vitro тези интрони сами се отделят от пре-РНК без участието на белтъци и други молекули РНК. В по-строг смисъл автокаталитичните интрони не са същински ензими, тъй като те участват само в един цикъл на катализа, респективно процесинг на РНК.

1. Автокаталитичен сплайсинг с участието на интрони от група I

Първата проява на каталитична активност в молекулите на РНК, проявена от интроните от група I е открита в рРНК от голямата субединица на рибозомите при Tetrahymena termophila. Интрони от група I са открити в голям брой тРНКи, мРНКи и рРНКи.

Механизмът на действие на автокаталитичните интрони от група I е различен от този на група II. Функцията на адениновия остатък в точката на разклонение се изпълнява от гуанинов (G) рибонуклеотид или рибонуклеозид, който е свободен, а не интегрална част от молекулата на пре-мРНК. Този нуклеотид/нуклеозид асоциира с пре-РНК и неговата 3’-ОН група се доставя до 5’-мястото за сплайсинг, като се извършва нуклеофилна атака от ОН групата върху фосфодиестерната връзка между последния нуклеотид на екзон 1 и 5’-крайния нуклеотид на интрона (5’-splice сайт).

В резултат на реакция на трансестерификация гуаниновият рибонуклеотид се свързва с 5’-края на интрона – формира се ковалентна връзка G-U. (Реакцията на срязване протича downstream от консервативната U-G базова двойка). Втората реакция протича по абсолютоно същия начин, както и при останалите два вида спалйсинг – освободеният 3’- ОН край в 5’-екзона атакува 3’-мястото за сплайсинг, при което интронът се освобождава в линейна (не под формата на "ласо") форма и двата екзона се свързват. Реакцията е напълно обратима, така че интронът може да се вмъкне между двата екзона.

Интроните от група I са по-малки от тези от група II и имат консервативна вторична структура (състояща се от сърцевина от 9 сдвоени участъка, формиращи два домена). Те съдържат ‘джоб’, в който се свързват гуаниновите рибонуклеотиди или рибонуклеозиди. Този джоб прави дискриминация между рибо- и дезоксирибонуклеозиди. Освен това интроните от група I съдържат вътрешна насочваща последователност (IGSinternal guide sequence), която се сдвоява с 5’-мястото за сплайсинг и по този начин прецизно определя точното място, където да се извърши нуклеофилната атака от страна на G-нуклеотида/нуклеозида.

2. Автокаталитични интрони от група II

Автокаталитичните интрони от група II са големи каталитични РНК молекули с компактна структура. Открити са в бактерии, растения, фунги и дрожди. Представени са главно в мРНК, но също се откриват в тРНК и гените за рРНК. Вторичната им структура включва 6 домена, като само 1 и 5 са крайно необходими за катализа. Домен 5 е каталитичен център. 

Автокаталитичните интрони от група II извършват сплайсинга по същия механизъм (с образуването на същите междинни продукти), по който протича сплайсинга на пре-мРНК с участието на сплайсозоми. Тези интрони използват аденинов остатък в точката на разклонение, за да атакуват фосфодиестерна връзка в 5’- мястото за сплайсинг. В резултат на тази атака се образува разклоненото "ласо", след което новообрзуваният 3’-ОН край в 5’-екзона атакува 3’-мястото за сплайсинг, при което интронът се освобождава, а двата екзона се свързват. Някои рибозими от тази група са способни да се вмъкват в двойноверижни ДНК молекули, посредством обратен сплайсинг и транскрипция, което повишава подвижността на тези елементи. Интроните от втора група могат да катализират и транс-реакции. Нуклеотидната последователност на субстрата, която се разпознава от рибозимите може да бъде доста дълга (>13 нуклеотида) и реакциите протичат с висока специфичност.

Разпознаването на 5’-екзона става чрез взаимодейстяие на IBS 1 и IBS 2 (intron binding sequences в 3’ края на екзона със специфичните секвенция ENS1 и EBS2 (exon binding sequences), намират се в домен 1 на интрона. По-нататъшното взаимодействия на секвенциите спомага за откриване на 5’-сплайсинг сайта.

Реакции, катализирани от интрони от втора група включват: срязване на лигирани РНК прекурсори, лигиране на РНК към ДНК и срязване на едноверижни ДНК-субстрати.

Един типичен автокаталитичен интрон от група I има дължина от 400 до 1000 нуклеотида и по-голямата част от съдържащата се в него информация (нуклеотидна последователност) е критична за реакцията на сплайсинг за разлика от интроните, които се отстраняват от спалайсозомите. Това е така, тъй като интронът трябва да се нагъне по специфичен начин, за да извърши реакцията на сплайсинг. В условия in vivo прецизната структура на интрона се стабилизира от взаимодействието му с белтъци. За реакцията на спалйсинг е необходимо определени области от фосфатния скелет в интрона да се доближат. Стабилизиращата функция на белтъците се изразява в неутрализиране на отрицателните заряди на фосфатните групи и улесняване на това сближаване. В условия invitroфункцията на стабилизиращите белтъци може да се компенсира от повишени солеви концентрации (респктивно положителни йони). Това е начинът, по който е установено, че белтъците не са съществени (определящи) за механизма на автокаталитичен сплайсинг.

RNaseP

Един от първите открити рибозими е RNase Р. Тя е убиквитинова ендонуклеаза, която участва във формирането на тРНК от по-голяма прекурсорна молекула, като къса РНК от към 5’-края. Открива се във всички клетки и органели, в които се извършва синтез на тРНК. Съставена е от РНК и белтък, като РНК молекулата е от съществео значение за активността (изключение прави РНазата от митохондрии, хлоропласти, някои растения и трипанозоми), а в бактериалните клетки може да осъществява процесинга на тРНК (каталитичната функция) с голяма прецизност дори в отсъствие на белтъчня компонент. Белтъкът играе ролята да екранира отрицателните заряди на скелета на РНК така, че тя да може да се свърже за отрицателния си субстрат.  Вероятно има значение и за скоростта на катализа, което се обуславя от увеличения афинитет на активния център към метални йони.

РНК компонентът на RNaseP при бактерии е между 350 и 410 нуклеотида.

РНК компонентът на Rnase P при E. coli (М1 РНК) е с 377 нуклеоида; белтъчноят компонент (С5) е с молекулна маса 17 500. Сидни Алтман и Норман Пейс установяват, че при определени условия, М1 РНК самостоятелно може да катализира срязването на тРНК прекурсорите в правилната позиция. РНазата разпознава пространствената конформация на пре тРНК, заедно с ССD последователността и така може да къса 5’ краищата на различни тРНКи. RNase Pна E. coli съществува къс двойноверижнен участък на 3’-края и се предполага, че тя може да разпознае всяка тРНК молекула, ако съществува т.нар EGS (external guide sequence). Прицелната РНК и EGS ще обр двойноверижен участък, който включва в себе си ССА триплета в 3’-края на EGS. Тази структура имитира природните субстрати на РНазата и следователно може да бъде разпозната от нея.

Кристалната структура на бактериалната Rnase P показва, че тя има гладка повърхност, оформена от няколко коаксиално подредени спирални домени, свързани посредством близки и далечни контакти. Тази повърхност благоприятства свързването и срязването на прекурсорната тРНК.

RNaseP при археи и еукариоти не поддържа самостоятелно каталитична функция, но е жизнено важна за каталитичната функция на холоензима.

При археи Rnase P се състои от 4-5 белтъчни субединици, свързани с РНК. Белтъчното съдържанеи е много по-голямо от това при бактерии. Наскоро е установено, че архебактерията Nanoarchaeum equitans няма Rnase P, като промоторът на тРНК е близо до самия ген за тРНК и транскрипцията започва от първата база на тРНК; по този начин се премахва необходимостта от РНазата.

При еукариоти в повечето случаи Rnase P съдържа РНК верига, която е сходна в структурно отношение с тази при бактерии, както и 9-10 белтъка (при бактерии е 1). 5 от тези белтъчни субединици са хомоложни на тези при археи. Тези белтъчни субединици са общи с Rnase MRP (каталитичен рибонуклеопротеин, който участва в процесинга на рРНК в ядърцето). RNaseP при ЕК е наскоро доказано, че е рибозим. Големият брой белтъчни субединици допринасят малко за процесинга на тРНК, но са от голямо значение при функционирането на RNaseи RNaseMRP в други процеси, като транскрипцията и клетъчния цикъл.

Първоначалните изследвания върху човешка RNase P показват, че тя проявява каталитичната си активност само ако ¾ от молекулите на тРНК са организирани като EGS. По-късни изследвания показват, че активността може да се прояви и при минимизирани ¾ EGS.

Rnase P в човешки митохондрии е белтък и не съдържа РНК компонент.

 

Малки каталитични РНКи

Този клас рибозими обхваща няколко типа каталитични РНКи с общи черти. Първо те са по-малки в сравнение с описаните до сега. Второ всички те участват в репликацията на РНК-геномите, в които се съдържат. Във всички случаи реакцията, катализирана от тези рибозими се осъществява чрез трансестерификация, при която се получава 5-хидроксилен и 2’,3’-циклично фосфатен краища.

Hammerhead рибозими

Чукоглавата РНК е специфична рибонуклеаза; осъществява мястоспецифично късане при Х17. Открива се при инфекциозни РНК агенти при растенията – вироиди, при които е необходимо да се осъществи късане, за да се разпространяват. Когато вироидът се реплицира, се получават много копия от него в една РНК молекула. Отделните вироиди се получават чрез късане, като то става посредством РНК последователността при свръзката. Такава самоизрязваща се последователност е чукоглавата РНК – името й идва от формата на вторичната й структура (състои се от 3 базово сдвоени стебла, заобикалящи сърцевина от некомплементарни нуклеотиди, която осъществява катализата.

Едноверижните области са висококонсервативни и включват важни нуклеотиди, определящи оптималната каталитична активност. Консенсусната последователност на мястото на срязване е установена като 5’-NHH↓ (N=к/о и да е нуклеотид; Н=А,С или У; ↓=място на срязване).

Комплексът между рибозимите и субстрата съдържа една външна верига и две вътрешни вериги, които се образуват след взаимодействие със субстрата.

При високо pH 2’-ОН групата на рибозата на РНК може да се депротонира и полученият (-) О може да атакува фосфатът при 3’ на същата рибоза. При това РНК се къса, като се получава 2’,3’ цикличен фосфат и свободен 5’-ОН. Така РНК може да се раздели напълно на нуклеотиди. Чукоглавата РНК също къса РНК чрез формиране на 2’,3’ цикличен фосфат. В процесът участва Mg++, който е свързан за рибозима и депротонира 2’-ОН при неутрално pH, при което следва нуклеофилна атака към фосфата. Чукогл РНК не е точно ензим, защото осъществява собственото си късане, т.е. извършва реакцията веднъж, но това може да се промени като се раздели на 2 – рибозим, съдържащ каталитичната сърцевина и субстрат, съдържащ мястото за късане.

Hairpin (фуркет) рибозими

За първи път hairpin мотивът е открит при (-) веригата на сателитната РНК, асоциирана с вируса на тютюневата мозайка. Впоследствие подобен мотив е установен при сателитните вируси по някои растения. In vivo той участва в прoцеса на репликация на сателитната РНК, в която е открит. Тази репликация протича по механизма на търкалящо се колело (така както и при hammerhead структурите). Тук фуркетата притежава лигираща способност. Той представлява ефективна РНК-лигаза, катализираща реакции на свързване и формиране на кръгови РНК молекули.

Hairpin рибозимите катализират реакци на срязване на субстрата по трансестерификационен механизъм. Реакцията не зависи от наличието на двувалентни йони, макар че последните стабилизират рибозимната структура. Най-добре структурата на фуркетния мотив се описва от модела на Hampel-Triz. Hairpin  рибозимата представлява РНК от 50 нуклеотида, която разпознава и срязва субстрат с дължина 14 нуклетида. Вторичната структура на рибозим-субстратния комплекс се състои от 2 домена – А и В. Доменът А е изграден от 2 вериги (1 и 2) и включва вътрешна бримка А. Този домен се формира от рибозимната и от субстратната молекула. Доменът В е изграден изцяло от рибозимната секвенция и включва 2 вериги (3 и 4) и вътрешна бримка В. Доменът А се огъва над домена В, при което нуклеотиди от двете бримки могат да взаимодействат помежду си. Този процес е крайно необходим за активиране на hairpin рибозима.

HDV-рибозими

HDV (hepatit delta virus) рибозимите имат характерна вторична структура. Тя се състои от 4 двуверижни области (Р1, Р2, Р3 и Р4). Р1 и Р2 домените образуват псевдовъзелна (pseudoknot) структура, а Р3 и Р4 формират структура от типа “стъбло-бримка”. Р1 домен определя мястото на срязване.

Установено е, че каталитичната активност на HDV-рибозимите е по-голяма в присъствието на двувалентни йони. HDV рибозимите са доста стабилни ех vivo. Тяхното време на полуживот е над 100 часа. Тази стабилност се определя от Р2 домена. HDV рибозимите могат да бъдат адаптирани изключително добре в човешки клетки и да бъдат използвани за регулация на генната активност.

US рибозими

Изолирани са от митохондрии на Neurospora. Те са отговорни за срязването и лигирането на US-РНК, която се транскрибира от US плазмидната ДНК. Каталитичната й активност се определя от фрагмент с дължина 154 нуклеотида. Вторичната структура на този вид рибозими се състои от 6 домена.

Максизми

Те са алостерични рибозими, чиято активност е повлияна от специфична секвенция в прицелната мРНК. Тази секвенция е наречена сензорна – тя физически се различава от мястото на срязване.

Максизимите се състоят от 2 минизими (делетирани hammerhead рибозими, които са актични само, когато са свързани в димер). Двете части на молекулата са конструирани така, че едната играе ролята на сензор, а другата носи каталитичата активност. Максизимите могат специфично да атакуват инфектирани с вирус клетки. Те са изключително тъканноспецифични.

 

Използвана литература:

1.      Lehninger principles of biochemistry (4th ed.): Nelson, D., and Cox, M.

2.      Molecular Cell Biology (8th ed): Lodish et.al.

3.      Molecular Biology Of The Cell (4th ed): Alberts B. et.al.

4.      Genes VIII: AND Molecular Biology of the Gene: Lewin B. et.al.

5.      https://www.znam.bg

6.      https://www.wikipedia.org

 

 

Добавете коментар

Защитен код
Обнови