РНК интерференция

Печат
Посещения: 5966

РНК интерференцията (RNAi) е система в живите клетки, която контролира кои гени са активни и до каква степен. Основната роля играят 2 типа РНК молекули – микро РНК (miRNA) и малки интерферентни РНКи (siRNA). Тези малки РНКи могат да се свързват специфично към други РНКи, като по този начин модулират тяхната активност, например ако попречат на транслацията на иРНК. РНК интерференцията има важна роля при защитата на клетките срещу паразитни гени – вируси или транспозони; също така и в насочване на развитието, както и в генната експресия като цяло.

видео

 

RNAi пътят е открит при много еукариоти и се инициира от ензим DICER (ендорибонуклеаза), който срязва дълги двойноверижни РНКи (dsRNA) на къси фрагменти от около 20 нуклеотида. Една от двете вериги на всеки фрагмент (означава се като водеща или guide верига) впоследствие се инкорпорира в комплекс RISK (RNA-induced silencing complex). Най-добре изученият ефект е пост-транскрипционно заглушаване (silencing) на определен ген, който се наблюдава когато водещата верига се сдвоява с комплементарна последователност от иРНК молекула и индуцира срязване от каталитичния компонент на RISK – Argonaute белтък.

Селективното и силно действие на РНК интерференцията върху генната експресия я прави важен инструмент за научни изследвания и при клетъчни култури и при живи организми, тъй като синтетични dsRNA внесени в клетката могат да потиснат специфично желани гени. Интерференцията може да се използва и за широкошобхватни проучвания, при които систематично се изключва всеки ген в клетката, който може да допринесе за идентифициране на компонентите, необходими за определен клетъчен процес.

През 2006 А. Файър и Крег Мело разделят Нобелова награда за физиология и медицина за работата им върху РНК интерференцията при нематоди.

Клетъчен механизъм

РНК интерференцията е РНК-зависим процес на генно заглушаване, контролиран от RISC комплекса и иницииран от къси двойноверижни РНК молекули в клетъчната цитоплазма, където взаимодействат с каталитичния компонент на RISC – argonaute. Когато двойноверижната РНК е екзогенна (от РНК вирус или получена в лаборатория), тя навлиза директно в цитоплазмата е се нарязва на къси фрагменти от Dicer. Инициаторната двойноверижна РНК може да е и ендогенна, например пре-микро РНК, експресирана от РНК-кодиращи гени в генома. Първичните транскрипти от такива гени първо търпят процесинг в ядрото, като се формират характерние за пре-микро РНК структури от типа стъбло-бримка. После те се експортират до цитполазмата и там се нарязват от Dicer. Така ендогенният и екзогенният път се сливат при RISC.

Ендогенните двойноверижни РНК инициират РНК интерференцията посредством активация на Dicer; фрагментите, които се получават под негово въздействие са с дължина около 21-25 базови двойки, като от двете страни на двойноверижната им част стърчат едноверижни участъци от по няколко бази. Дължината на фрагментите е оптимална по отношение на специфичността спрямо таргетния ген. Късите двойноверижни фрагмени се означават като малки интерферентни РНКи (siRNAs). Впоследствие те се разделят на едноверижни и се интегрират в активен RISC, след което формират базови двойки с таргетната иРНК и индуцират късането и, като по този начин предотвратяват използването и за матрица при транслация.

Екзогенните двойноверижни РНКи се разпознават и свързват от ефекторен б – RDE-4 (в кръгли червеи) или R2D2 (при Дрозофила). Той стимулира активността на Dicer. Този белтък свързва единстено дълги dsRNA, но механизма по който ги разпознава е непознат. Впоследствие тези РНК свързващи белтъци благоприятстват трансфера на накъсаните siRNAs в RISC.

При кръгли червеи инициаторният отговор са усилва от клетката посредством синтезата на популация от вторични siRNAs, която се осъществява като за матрица се използват получените от действието на Dicer първични (инициаторни) siRNAs. Тези вторични РНКи се различават структурно от първичните и вероятно се формират от РНК-зависими РНК полимераза.

Микро РНК (miRNA) – геномно кодирани нетранслиращи се РНКи, които участват в регулацията на генната експресия, особено по време на развитието. Зрелите микро РНКи са структурно подобни на siRNAs, получени от екзогенни двойноверижни РНКи, но преди да узреят, те първо претърпяват обширни посттранскрипционни модификации. Микро РНК се експресира от много по-дълъг ген като първичен транскрипт (pri-miRNA), който се процесира в ядрото до 70 нуклеотидна фуркетна структура (pre-miRNA) посредством микропроцесорен комплекс. Този комплекс се състои от RNase III ензим – Drosha (от първи клас РНаза III) и dsRNA-свързващ белтък – Pasha. Двойноверижната порция на тази пре-микро РНК се свързва и къса от Дайсер до зряла микро РНК, която може да се интегрира в RISC.

siRNAот дълги двойноверижни РНК прекурсори се различава от miRNA по това, че последната (особено при животински клетки) обикновено не осъществява пълно сдвояване с таргетната РНК и инхибира транслация от много различни иРНКи със сходни последователности. От друга страна siRNA обикновено се сдвоява перфектно и специфично с една таргетна молекула.

При Дрозофила и кръгъл червей miRNA и siRNA се процесират от различни argonaute и dicer.

Само една от двете вериги на фрагментите, продуцирани от dicer, се свързва с каталитичния белтък и насочва генното затихване; другата верига се разгражда по време на активацията на RISC. Разделянето на двете вериги е АТФ независим процес и се извършва директно от белтъчните компоненти на RISC. Обикновено водеща е веригата, чийто 5’-край е най-малко сдвоен с комплементарния му участък.

При взаимодействие между РНК и argonaute, 5’-фосфорилираният край на РНК навлиза в консервативен джоб на повърхността на белтъка, който съдържа основно базови аминокиселини. Контактът се осъществява посредством бивалентнен катион (като Мg) и stacking взаимодействия между 5’-нуклеотид в si RNA и консервативен тирозинов остатък. Вероятно по този начин се формира участък, в който може да започне свързването на siRNA с таргетната мРНК.

Каталитичните компоненти на RISC (argonaute)  са локализирани в специфични области в цитоплазмата, наречени Р-телца (от processing) или още GW телца или цитоплазмени телца – те са участъци с високи нива на разпад на иРНК. Активността на микро РНКите също е концентрирана в Р-телцата. Разрушаването на тези телца намалява ефективността на РНК интерференцията, което предполага, че те са участъци, в които се извършват важни стъпки от процеса. По принцип Р-телцата са отделни фокуси в цитоплазмата на еукариотите, които съдържат много ензими, включени в метаболизма на иРНКи по-точно – в разграждането и (нонсенс медиирано разграждане, разграждане, обусловено от богати на AU елементи, иРНК сайлънсинг, обусловен от микро РНКи).

Компонентите, участващи в РНК интерференцията, се използват в много еукариоти при поддържането на организацията и структурата на генома. Модификацирането на хистоните и формирането на хетерохроматин води до претранскрипционно потискане на гени, този процес се означава като РНК-индуцирано транскрипционно заглушаване (RITS) и се осъществява с помощта на комплекс от белтъци, нар RITS. Делеции в гените за тези белтъци при дрожди водят до нарушаване на хистоновото метилиране и формирането на центромери, при които се забавя (нарушава) анафазата. Механизмът, по който RITS индуцира формирането и организацията на хетерохроматин е ненапълно изяснен. При организирането на съществуващи хетерохроматинови участъци, RITS формира комплекс със siRNAs, комплементарни на локалните гени и стабилно свързва метлириани хистони, като същевременно действа котранскрипционно като разгражда всички нововъзникващи пре-мРНК транскрипти, инициирани от РНК полимеразата, така се формират нови siRNA, които се инкорпорират в локалните RITS.

Биологични функции на РНК интерференцията

Имунитет

РНК интерференцията е важна част от имунния отговор спрямо вируси и други чужди генетични материали, особено при растения, където предотвратява и разпространението на транспозони. Някои растения експресират различни хомолози на dicer, които са специализирани за различни вируси. От друга страна много растителни вируси са развили механизми за противопоставяне на РНК интерференцията. Те включват вирусни белтъци, които свързват къси двойно верижни РНК фрагменти с едноверижни лепливи краища (като тези, получени при действието на dicer).

Като цяло животните експресират по-малко варианти на dicer в сравнение с животните, но РНК интерференцията също участва в антивирусния отговор, например при дрозофила, РНК интерференцията е част от антивирусния вроден имунитет (активира се срещу Х вирус).

Заглушаване на гени

Ендогенно експресираните миРНКи (както интронни, така и интергенни) са най-важни при репресията на транслацията, както и при регулацията на развитието (особено при синхронизиране на процесите на морфогенеза и регулация на недиференцирани или не напълно диференцирани клетъчни типове, например стволови клетки). При растения по-голямата част от гените, регулирани от миРНК са транскрипционни фактори, което означава, че активността на тези РНКи всъщност регулира цялата генетична мрежа по време на развитието, като модулира експресията на ключови регулаторни гени (примерно ТФ, както и F-box белтъци). При много организми, включително при човек, миРНК са свързани с формирането на тумори и нарушенията в регулацията на клетъчния цикъл (тук миРНК могат да действат и като онкогени, и като туморни супресори).

Активиране на гени

РНК последователности (siRNA и miRNA), които са комплементарни на части от промотора, могат да доведат до стимулиране на генната транскрипция (РНК активация). Част от механизмите на активиране е хистонова деметилация.

Използвана литература:

1.      Lehninger principles of biochemistry (4th ed.): Nelson, D., and Cox, M.

2.      Molecular Cell Biology (8th ed): Lodish et.al.

3.      Molecular Biology Of The Cell (4th ed): Alberts B. et.al.

4.      Genes VIII: AND Molecular Biology of the Gene: Lewin B. et.al.

5.      https://www.znam.bg

6.      https://www.wikipedia.org