Нуклеинови Киселини

Печат
Посещения: 14669

Аминокиселинната последователност на всеки белтък в клетката, както и нуклеотидната последователност на всяка РНК се определят от нуклеотидната последователност на клетъчната ДНК. Сегментът от ДНК, който съдържа информация за синтезата на функционален биологичен продукт (белтък или РНК) се нарича ген. Обикновено клетките съдържат много хиляди гени и съответно ДНК е огромна м-ла. Съхранението и предаването на генетичния материал са единствените познати функции на ДНК.

РНК от своя страна има повече функции: рибозомната РНК е компонент на риобозомите, които осъществяват белтъчния синтез. Матричната РНК (иРНК) е междинен преносител на генетичната информация от един или няколко гена до рибозомата, където се изгражда съответният белтък. Транспортната РНК превежда информацията от иРНК в специфична последователност от ак. Освен тези 3 основни класа РНК има и голямо разнообразие от други РНК с различни функции.

Нуклеотидите, които изграждат нуклеиновите кислелини, имат 3 характеристични компонента: азотна база; пентоза и фосфат. Молекула без фосфатна група се нарича нуклеозид. Азотните бази са производни на примидин или пурин. Базите и пентозите на основните нуклеотиди са хетероциклени съединения. Базата е свързана ковалентно (при N-1 на пиримидинте и при N-9 на пурините) чрез β-гликозилна връзка с 1´ С атома на пентозата, а фосфатът е естерифициран при 5´ С атома.-β-гликозилната връзка се формира чрез отнемане на йоните на водата (хидроксилна група от пентозата и водород от базата).

РНК и ДНК съдържат по 2 главни пуринови бази (аденин и гуанин) и по 2 главни пиримидинови. И в ДНК, и в РНК единият пиримидин е цитозин. Вторият при ДНК е тимин, а при РНК – урацил. Много рядко може да се случи при РНК да е тимин, а при ДНК – урацил.

НК имат и 2 типа пентози: 2´-дезокси-D-рибоза при ДНК и D-рибоза при РНК. При нуклеотидите и двата типа рибоза са в β-фуранозна форма (затворен 5 въглероден пръстен). Пентозният пръстен не е планарен и има няколко конформации. Четирите майорни дезоксирибонуклеотида са структурните единици на ДНК, а четирите главни рибонуклеотида – на РНК. От друга страна и при РНК, и при ДНК могат да се съдържат и някои минорни бази.

В ДНК най-често се срещат метилирани форми на главните бази. При някои вирусни ДНК определени бази могат да бъдат хидроксиметилирани или гликозилирани. Такива необичайни бази при ДНК обикновено имат регулаторна или защитна функция за генетичния материал. Минорни бази се срещат и при РНК, особено при тРНК. 5-метилцитидин в ДНК се среща при животни и висши растения. N6-метиладенозин се среща в бактериална ДНК, 5-хидроксиметилцитидин – в ДНК на бактерии, инфектирани с определени бактериофаги. Инозинът при тРНК съдържа базата хипоксантин. При псевдоуридина урацилът е свързан с рибозата при С-5. Клетките също така съдържат нуклеотиди с фосфатна група в позиция, различна от при 5´ С атома.

 Рибонуклеозид 2´,3´-цикличните мoнофосфати са изолируеми междинни продукти, Рибонуклеозид 3´-мoнофосфатите са крайни продукти от хидролизата на РНК от опр рибонуклеази. Други са аденозин 3´,5´-цикличният монофосфат (cAMP) и гуанозин 3´,5´-цикличният монофосфат (cGMP).

Последователните нуклеотиди в ДНК и РНК са ковалентно свързани с посредством фосфатните групи, като 5´-фосфатната група на 1 нуклеотид е свързана с 3´-хидроксилната група на следващия, при което се формира фосфодиестерна връзка.

Така ковалентният скелет на НК се състои от редуващи се фосфатни и пентозни остатъци, а азотните бази могат да се приемат като странични групи, свързани към скелета през равни интервали. Скелетът на ДНК и РНК е хидрофилен. Хидроксилните групи на захарта формират Н връзки с водата. Фосфатните групи са с pKa близо до 0 и са напълно йонизирани и отрицателно заредени при pH 7. Отрицателните заряди се неутрализират посредством йонни взаимодействия с положителните заряди на белтъци, метални йони и полиамини.

Всички фосфодиестерни връзки имат една и съща ориентация по дължината на веригата, което обуславя нейната полярност и различаващите се 5´ и 3´ краища. По определение при 5´ края няма нуклеотид в 5´ позиция, а при 3´ - няма нуклеотид в 3´ позиция (ДНК има свободна 5´-фосфатна или 5´-ОН в единия край и свободна 3´-фосфатна или 3´-ОН в другия). Във всеки от двата края могат да присъстват други групи (най-често фосфати).

Ковалентният скелет на НК търпи бавна неензимна хидролиза на фосфодиестерните връзки. В епруветка РНК се хидролизира по-бързо в алкална среда докато ДНК – не; вероятно в процеса участват 2´-хидроксилните групи на РНК. Първите продукти от действието на алкалните условия върху РНК са цикличните 2´, 3´-монофосфатни нуклеотиди. Те бързо хидролизират до смес от 2´- и 3´-нуклеозид монофосфати.

Къса НК се означава като олигонуклеотид (с до 50 нд), а по-дългите – полинуклеотид.

Пространствената структура на НК се повлиява от характеристиките на азотните бази. Свободните пиримидини и пурини са  слабо основни (затова са бази). Те притежават разнообразни характеристики, които повлияват структурата и съответно функцията на НК. Главните бази на ДНК и РНК са с висока степен на спрягане. Това е важно свойство за структурата, електронното разпределение и поглъщането на светлината от молекулите. Резонансът при атомите в пръстена придава на повечето връзки характер на частично двойни. Един от ефектите е, че пиримидините са планарни молекули; пурините са с близка до планарна структура с лека чупка. Свободните пиримидини и пурини могат да съществуват в зависимост от pH  в 2 тавтомерни форми, които са в равновесие.

Азотните атоми, свързани към пуриновите и пиримидиновите пръстени са в амино форма и много рядко приемат имино конформация. Също така, О атоми при гуанина и тимина нормално са в кето форма и рядко приемат енолна конформация. Възможността са съществуване в различни тавтомерни форми е честа причина за грешки по време на ДНК синтезата.

В резултат от наличието на резонанс всички азотни бази абсорбират UV светлина и НК се характеризират със силно поглъщане при λ=260 nm.

Пурините и пиримидините са хидрофобни и относително неразтворими във вода при pH на клетките. В киселинна или алкална среда базите се зареждат и разтворимостта им във вода нараства. Важни взаимодействия между базите в НК са хидрофобните взаимодействия, при които 2 или повече бази са позиционирани така, че равнините на пръстените им са успоредни. Други поддържащи структурата взаимодействия са комбинация от Ван-дер-Ваалсови и дипол-диполни взаимодействия между базите. Всички тези взаимодействия свеждат контакта на базите със водата до минимум и са много важни за поддържане на пространствената структура на НК.

Най-важните функционални групи на пиримидините и пурините са азотните атоми в пръстените, карбонилните групи и екзоциклените амино групи. Н връзки с участието на амино- и карбонилните групи са други важни взаимодействия между базите. Те позволяват комплементарно свързване между 2 и повече вериги на НК. Най-важни са Н връзки, установени от Уотсън и Крик (1953), при които А се свързва специфично с Т ( или U), а G – с С. Тези 2 типа базови двойки преобладават в двойната верига на ДНК и РНК. Стриктността при асоциирането на базите се определя от комплементарността и по отношение на формата, и по отношение на Н връзките. Тези двойки се формират при условие, че базите са в предпочитаната си тавтомерна форма. Важна характеристика на двойната спирала е фактът, че двете двойки бази имат еднаква геометрия и разстоянията между веригите са еднакви независимо от базовия състав.

Н връзки между комплементарните бази са фундаментална характеристика на двойната спирала, допринасяйки за нейната ТД стабилност и специфичността на нуклеотидното сдвояване. По принцип изглежда, че Н връзки не могат да допринесат значително за стабилността на ДНК по следната причина: при всяка органична молекула във воден разтвор всички възможности за формиране на Н възкир са задоволени с водни молекули, като тези връзки са динамични – бързо се формират и разрушават. В резултат за всяко новообразувана Н вр между комплементарни бази се разрушава една Н връзка с водата. От друга страна, когато двете вериги са разделени, водните молекули са подредени около всяка от тях. При сдвояване на веригите тези водни молекули се изместват, което води до повишаване на ентропията и следователно стабилизиране на двойната спирала. Н възкир не са единствения фактор, стабилизиращ двойната спирала. Важен принос имат и stacking взаимодействията между базите. Базите са плоски и относително неразтворими във вода всяка от тях се подрежда със съседната (в единичната верига) база в посока, перпендикулярна на оста на спиралата. При това подреждане се осъществяват взаимодействия между електронните облаци на базите (π-π взаимодействия), които стабилизира двойната спирала.

Понякога отделни бази могат да стърчат встрани от молекулата. Съществуват ензими, които метилират определени бази или премахват повредени бази и за да попадне базата в активния им център, те трябва да я отделят от двойната верига; ензими, които участват в хомоложната рекомбинация или в поправката на ДНК вероятно използват същия механизъм при сканирането на веригата за наличие на хомоложност или за лезии. Този процес не изразходва много енергия, тъй като се разрушават Н връзки само при една база.

 

Структура на Нуклеиновите киселини.

През 1953 Дж. Уотсън и Ф. Крик откриват структурата на ДНК на базата на х-лъчева дифракция. Първичната структура на НК е нейната ковалентна структура и нуклеотидна последователност. Всяка една правилна стабилна структура, която някои или всичките нуклеотиди в една НК приемат се означава като вторична структура. Комплексното нагъване при хромозомите в еукариотния хроматин и бактериалните нуклеоиди е третична структура.

Биохимичното изучаване на ДНК започва с Фридрих Мишер, който прави систематични химични изследвания на клетъчното ядро. През 1868 Мишер изолира субстанция, съдържаща фосфор, която нарича нуклеин. Той установява, че нуклеинът съдържа кисела част (ДНК) и основна част (белтък). Мишер частично пречиства нуклеина и изучава свойствата му, но ковалентната структура на ДНК остава неразгадана до 40те г на XX в. Мишер и други учени преполагат, че нуклеинът е свързан по някакъв начин с клетъчната наследственост. През 1944 О. Ейвъри, К. Маклауд и М. Маккарти откриват, че ДНК от болестотворен щам на Streptococcus pneumoniae генетично трансформира неболестотворната форма в болестотворна. Още през 1928 Грифит провежда експеримент, който показва, че бактериите са способни да осъществяват трансфер на генетична информация чрез процеса трансформация. Грифит използва двата щама пневмококи – тип S (smooth) и тип R (rough). S имат полизахаридна капсула, която ги предпазва от имунната система на гостоприемника, т.е. те са вирулентни. Другият щам нямат капсула. В експеримента Грифит прибавя термично убити S бактерии към непатогенните R бактерии. Докато двата щама поотделно (термично обработените S бактерии и R щама) не били смъртоносни за мишките, инжектирането на комбинацията от тях водело до смъртта на гостоприемника.

Механизмът на трансформация установяват Ейвъри, Маклауд и Маккарти при техния експеримент, проведен през 1944. Те изолират ДНК от термично убитите бактерии, като я пречистват максимално добре от белтъка и я прибавят към невирулентния щам на пневмококите. ДНК м-лата преминава в клетките на бактерии от този щам и ги превръщат в патогенни S бактерии. Ейвъри и екипът му достигат до извода, че ДНК, изолирана от S щама носи наследствената информация за вирулентност. По-късно това се потвърждава и от факта, че протеолитичните ензими не повлияват процеса на трансформация за разлика от дезоксирибонуклеазите.

Друг важен експеримент, който показва, че ДНК носи наследствената информация провеждат А. Херши и М. Чейс (1952). Те използват радиоактивен фосфор-32 и радиоактивна сяра-35 за маркери, с които показват, че когато бактериофагът Т2 инфектира E. coli, частта от него, която прониква в клетката-гостоприемник и предоставя генетичната информация за вирусна репликация е фосфор-съдържащата ДНК, а не сяра-съдържащите белтъци, изграждащи обвивката на вируса.

През 40те години на XX в. Чаргаф установява, че четирите азотни бази в ДНК са в различно съотношения при различните организми, както и, че количествата на определени бази са свързани. На базата на експериментите си Чаргаф извежда няколко правила:

1.      Нуклеотидният състав на ДНК варира при различните видове организми

2.      ДНК, изолирана от различни тъкани на един и същ организъм е съставена от еднакви бази.

3.      Нуклеотидният състав на ДНК при даден организъм не се променя с възрастта, храненето или промяна в местообитанието.

4.      при всички клетъчни ДНК молекули, независимо от вида организъм, броят аденозинови остатъци е равен на броя тимидинови остатъци, а борят гуанозинови остатъци е равен на броя цитидинови остатъци, т.е. А+G = T+C.

За да анализират ДНК нишките, в началото на 50те г на XX в. Р. Франклин и М. Уилкинс използват х-лъчева дифракция. От изображението, което получават, стигат до извода, че ДНК молекулата е спирална и има 2 периодичности по продължение на дългата ос – една на 3,4 и една на 34 Å. От наличната информация Уотсън и Крик правят модел на триизмерната структура на ДНК през 1953. Установяват, че тя се състои от 2 спирални вериги, които са усукани около една и съща ос и формират дяснозавита двойна спирала. Хидрофилният скелет от редуващи се дезоксирибоза и фосфатни групи са от външната страна на спиралата, насочени към водната среда. Фуранозният пръстен на всяка дезоксирибоза е в С-2′ ендо конформация. Базите са насочени навътре, като техните хидрофобни и почти планарни пръстени са много близо един до друг и перпендикулярни на дългата ос. При сдвояването на двете вериги се образуват голяма и малка бразда на повърхността на дуплекса. Всяка нуклеотидна база от едната верига се сдвоява в същата равнина с база от другата верига. Сдвояването е между G и С и между А и Т, като между първите 2 могат да се формират 3 Н възки, а между А и Т – 2. Тези асоциации се наричат Уотсън-Крикови взаимодействия. Това обяснява защо в експеримент за разделяне на дв ДНК вериги, това става по-трудно с повишаване на съотношението G и С към А и Т. Всякакви други сдвоявания между базите водят до дестабилизиране на двойната спирала. Веригите в двойната спирала са антипаралелни – техните 5′,3′-фосфодиестерни връзки имат противоположа насоченост. Според молекулните модели на Уотсън и Крик, базите във всяка верига отстоят на 3,4 Å, а стъпката на спиралата съдържа 10 нуклеотида и е дълга 34 Å. Във воден разтвор структурата се различава малко, като на завивка на спиралата има 10,5 нд (36Å). В най-дебелата си част спиралата е с диаметър 20 Å. Двете антипаралелни полинуклеотидни вериги не са идентични, а са комплементарни една на друга.

При формирането на малка и голяма бразда, атомите на ръбовете на всяка база в тези бразди са достъпни и формират две свързващи повърхности за белтъци. Тези атоми могат да служат като донори и акцептори във Н вр или да участват Ван-дер-Ваалсови взаимодействия . Основата на голямата бразда е покрита с горната част на базите, а малката – с долната. Наличието на такива характерни възможности за точно определени взаимодействия позволяват разпознаване на ДНК участъци от определени белтъци без разделяне и разрушаване на двойната спирала. Много често принципът на разпознаване на ДНК се състои в проникване на странична верига на определени аминокиселини в голямата бразда. Малката бразда не е толкова богата на химична информация по няколко причини: малък размер (страничната верига на аминокиселините не може да се позиционира лесно); А:Т и Т:А, както и G:C и C:G двойките изглеждат еднакво в малката бразда). 

Пространствени конформации на ДНК.

ДНК е много гъвкава молекула. Възможно е въртене при много от връзките във фосфодезоксирибозния скелет на молекулата. Освен това различни температурни колебания могат да доведат до огъване, разпъване или разделяне на двойната спирала. В ДНК са открити много отклонения от структурата на Уотсън и Крик, част от които имат важна роля при метаболизма на ДНК. Като цяло тези отклонения не засягат ключовите характеристики на ДНК – комплементарността на веригите и сдвояването между базите.

Структурната вариация на ДНК отразява 3 неща: различни конформации на дезоксирибозата; въртенето около съседните връзки, изграждащи фосфодезоксирибозния скелет на молекулата; свободното въртене около С-1′-N-гликозилната връзки.

Конформацията на нуклеотидите в ДНК се повлиява от въртенето около 7 връзки. 6 от тях се въртят свободно, а ограниченото въртене около връзка 4 води до появата на чупка, при кетоо 1 от атомите в петчленния фуранозен пръстен е извън равнината, определена от другите 4. Тази конформация е ендо или екзо в зависимост дали атомът отместен към страната на С-5′ или на другата страна на равнината.

Поради стеричното пречене пурините при пуриновите нуклеотиди са ограничени до 2 стабилни конформации по отношение на дезоксирибозата , които се означават като син и анти. Пиримидините могат да приемат само анти конформация, тъй като има стерично взаимодействие между захарта и О атом от карбонилната група при С-2 на пиримидина.

Структурата на Уотсън и Крик се означава като B-ДНК. В формата е най-стабилната структура при физиологични условия, независимо от нуклеотидната последователност. Установени са още 2 структури – А и Z

А формата се формира при ниска влажност. При тази форма ДНК е също дяснозавита двойна спирала, но тя е по-широка и броят бази на стъпка е 11. Равнината на двойките бази при А-ДНК е наклонена с 20° спрямо оста на спиралата. Тези структурни особености обуславят по-дълбока голяма бразда за сметка на по-плитка малка. Реагентите, които се използват при кристализиране на ДНК, водят до нейната дехидратация и затова по-късите ДНК молекули показват тенденция да кристализират в А-форма. А форма се наблюдава при някои ДНК-белтъчни комплекси. А формата също така е близка до структурата на РНК, когато тя формира двойноспирални участъци.

Z-формата на ДНК е лявозавита спирала. На завивка на спиралата има 12 нуклеотида и тя е издължена и по-тънка. Скелетът на молекулата има зигзаговидна форма. Някои нд последователности показват тенденция към формиране на лява спирала. Най-често това са последователности, при които се редуват пуринови и пиримидинови остатъци, особено С и G или 5-метил-С и G. За да се формира Z спиралата, пуриновите остатъци преминават в син конформация, редувайки се с пиримид остатъци в анти конформация. При тази структура на ДНК голямата бразда е по-слабо забележима, а малката е тясна и дълбока. Присъствието на А-ДНК в клетките не е сигурно, но съществуват доказателства за наличието на къси участъци от Z-ДНК при про- и еукариоти. Тези участъци вероятно имат регулаторна роля при генетичната експресия или участват в генетичната рекомбинация.

В състава на хромозомите са открити и друг зависещи от нуклеотидната последователност структурни вариации, които оказват въздействие върху функциите и метаболизма на съседните ДНК сегменти. Например при последователно свързване на 4 или повече А остатъци в едната верига, се наблюдава огъване на спиралата. Последователност от 6 А нуклеотида обуславя огъване на 18°. Такова огъване може да има отношение към свързването на различни белтъци с ДНК. По-често срещани в ДНК са палиндромните поледователности (палиндром е дума, която се чете еднакво отзад напред и отпред назад) – това са участъци от ДНК, които представляват обърнати повтори от нуклеотидни последователности с двустранна симетрия на двете вериги. Такива последователности са взаимно комплементарни вътре във всяка от двете вериги и по тази причина могат да формират структури, като hairpin (когато само една верига ДНК или РНК участва в структурата) или cruciform (когато участват двете вериги от двойната спирала на ДНК). Когато обърнатите повтори се намират във всяка от двете вериги, последователността се означава като огледален повтор. Огледалните повтори не могат да формират hairpin или cruciform.

Такива последователности се наблюдават във всяка голяма ДНК молекула и могат да обхващат няколко до хиляди бази. Наличието на такива взаимно комплементарни последователности води до нагъването на изолирани единични ДНК и РНК вериги в комплекси, съдържащи множество такива структури.

При ДНК се наблюдават и структури, които обхващат 3 и дори 4 ДНК вериги и често са свързани с участъци от ДНК, в които стават важни събития, например иницииране или регулация на репликация, рекомбинация или транскрипция. Нуклеотидите, участващи във Уотсън-Крикови взаимодействия могат да формират и допълнителни Н връзки, особено с функционални групи, позиционирани в голямата бразда. Например цитидинов остатък (при условие, че е протониран) може да се сдвои с гуанозинов остатък от двойка G≡C, а тимидинов остатък може да се сдвои с аденозинов от А=Т двойка.

N-7, O6 и N6 от пурините (атомите, които участват в Н връзките при формиране на тройна ДНК спирала) често се означават като Hoogsteen позиции и тези различни от Уотсън-Криковите асоциации се означават като Hoogsteen взаимодействия (Karst Hoogsteen първи открива потенциала за формиране на такива връзки през 1963). Hoogsteen взаимодействията позволяват формиране на тройна ДНК. Структурите, показани на фигурата са стабилни при ниско pH, т.като при C≡G•C+ е необходим протониран цитозин. При триплекса pKa на този цитозин е >7,5 (докато нормалната стойност е 4,2). Триплекси се формират лесно и при дълги последователности, съдържащищи само пиримидини или само пурини в едната верига. Някои тройни ДНК спирали съдържат 2 пиримидинови и една пуринова вериги, а други – 2 пуринови и една пиримидинова.

Възможно е и асоциирането на 4 ДНК вериги, което се наблюдава при наличие на ДНК последователности с много голям процент гуанозинови остатъци. Гуанозиновият тетраплекс (G ДНК) е стабилен при разнообразни условия. G бази често преобладават в края на еукариотните хромозоми и там се създава възможност за формиране на такива структури. Обикновено в края на хромозомата няма пълна комплемементарност и тези участъци стърчат и се нагъват, формирайки тези структури. Има значение за кондензацията на хроматина.

Среща се и т.нар. H-ДНК, тя се наблюдава в полипиримидинови или полипуринови участъци, които също така включват и огледален повтор. Прост пример е дълъг участък от редуващи се Т и С остатъци. Н-ДНК е например тройна спирала с 2 вериги от пиримидини и една от пурини.

В ДНК на живите клетки участъци, разпознавани от специфични ДНК-свързващи белтъци, са организирани под формата на палиндроми и полипиримид и полипуринови последователности, които могат да формират тройни спирали или H-ДНК се наблюдават в участъци от значение за регулацията на експресията на някои еукариотни гени. Контрол върху кл метаболизъм може да се постигне чрез синтетични ДНК вериги, конструирани така, че да асоциират с тези последователности, да формират тройни ДНК и така да повлияват генната експресия.

 

Използвана литература:

1.      Lehninger principles of biochemistry (4th ed.): Nelson, D., and Cox, M.

2.      Molecular Cell Biology (8th ed): Lodish et.al.

3.      Molecular Biology Of The Cell (4th ed): Alberts B. et.al.

4.      Genes VIII: AND Molecular Biology of the Gene: Lewin B. et.al.

5.      https://www.znam.bg

6.      https://www.wikipedia.org

 

 

Добавете коментар

Защитен код
Обнови

Подобни статии