Репликация на ДНК

Печат
Посещения: 20185

Репликацията на ДНК е процес, при който от една молекула ДНК се получава нейно напълно идентично копие. Репликацията е в основата на деленето на клетките и на размножаването на организмите, както и на свойството наследственост (приемственост между поколенията). Възможността за осъществяване на процеса на репликация се дължи на комплементарността на базите в двете вериги от двойната спирала на ДНК. Тази комплементарност означава, че подредбата на нуклеотидите в едната верига определя подредбата им в другата. При репликацията на ДНК двойната спирала се разплита, като всяка от веригите служи като модел (матрица) за синтез на нова комплементарна верига.

Репликацията на ДНК протича по полуконсервативен механизъм. Това означава, че всяка от двете вериги от изходната молекула ДНК служи като матрица за изграждане на дъщерна верига, като след завършване на процес се получават две идентични копия, всяко от които включва една родителска и една наново синтезирана (дъщерна) верига ДНК. 

Независимо дали ДНК молекулата е с кръгова или линейна форма, репликацията й започва от т.нар. начало на репликация, което се означава като ori (от origin of replication). И докато при кръговите ДНК молекули, които са характерни за бактериалните геноми и геномите на някои вируси и плазмиди, има обикновено едно начало на репликация, при линейните ДНКи, характерни за еукариотните организми съдържат много на брой начала на репликация. 

Репликацията на ДНК е двупосочна, т.е. започва в двете посоки от ori. Там където се в даден момент протича репликация, се формира характерна структура, наречена репликативна вилка. Репликони са участъците от реплициращата се ДНК, в които еднократно се е инициирала репликацията, т.е. линейните ДНК молекули имат и повече от един репликони, което осигурява по-голяма бързина и ефективност на репликацията. Малките кръгови геноми обикновено са един репликон, като репликацията при тях протича с формиране на θ-структури и завършва в участък, срещуположен на ori (прочината е, че протича с еднаква скорост в двете посоки).

За да започне репликацията на ДНК са необходими няколко фактора. От една страна това са участъците от самата ДНК молекула, в които процесът започва и един от тях е ori, богат на А-Т двойки участък Това са т.нар цис-елементи (или репликатор). Освен началото на репликация, към цис-елементите се включват по-големи области от ДНК, които участват пряко в инициацията на процеса. От друга страна са транс-действащите фактори (белтъци), например инициаторните белтъци, които разпознават определени последователности от ДНК и се свързват с тях, като осъществяват контрола върху процеса. Към транс-действащите фактори спадат и белтъчни молекули, които се участват в репликацията, свързвайки се за инициаторните белтъци посредством белтък-белтъчни взаимодействия, както и белтъчни молекули, които разпознават специфични структури от ДНК, например SSB белтъците, които разпознават и свързват едноверижна ДНК.

Посоката, в която нараства новата верига е винаги една и съща - от 5' към 3'

Основен за репликацията е ензимът ДНК-зависима ДНК-полимераза. Тези полимерази създават фофодиестерните връзки между нуклеотидите, като използват правилото за комплементарност. Новите нуклеотиди, които се сързват при процеса са под формата на нуклеозидтрифосфати и макроергичните връзки между фосфатните групи в тях  осигуряват необходимата за процеса енергия. Активният център на полимеразата е един за всички нуклеотиди, а това кой нуклеотид ще се свърже в новата верига се определя от старата верига по правилото за комплементарност. Ако попадналият в каталитичния център нуклеотид не е правилният, разстоянието между двата нуклеотида, между които трябва да се формира фосфодиестерна връзка не е подходящо и скоростта на процеса пада около 10 000 пъти. Също така не е възможно свързването на рибонуклеозидтрифосфати, въпреки че  са много повече от дезоксирибонуклеозидтрифосфатите. Причината е в допълнителната хидроксилна група при 2' на рибозата, която обуславя по-големия обем на рНТФ и следователно невъзможността им да навлязат в каталитиния център на ензима.

ДНК полимераза

ДНК полимеразата е сложен белтък, съставен от няколко домена. Така наречената "длан" има най-много β–структури и в нея е каталитичният център. В него се свързват два двувалентни метални катиона (Mg2+ или Zn2+). Единият от тях улеснява депротонирането на 3'-ОН края и неговата нуклеофилна атака върху α-фосфатната група на постъпващия дНТФ. Вторият координира отрицателните заряди на β- и γ- фосфатните групи в дНТФ и стабилизира освобождаващия се пирофосфат. Мястото на двата метални йона е фиксирано от два аспарагинови остатъка в активния център на ензима. "Дланта" формира множество водородни връзки с базови двойки в малката бразда на новосинтезираната ДНК. Тези връзки могат да се осъществят само ако свързаните нуклеотиди са комплементарни. Те се разрушават след всеки каталитичен акт и преди следващия се създават нови. Така ДНК се "приплъзва" по ензимната повърхност. Друг домен от ензима се означава като "пръсти". Постъпвящият НТФ взаимодейства с аминокиселинни остатъци в този домен, като базата формира стекинг-взаимодействия с тирозинов остатък, а β- и γ- фосфатните групи формират йонни връзки с един аргининов и един лизинов остатък. При това  взаимодействие става завъртане под ъглъл от 40°на домена, като само в тази затворена конформация 3'-ОН края и новопостъпилият НТФ са на оптимално разстояние и може да протече катализа. В областта на "пръстите" става огъване на старата верига от ДНК под ъгъл 90°, като така в каталитичния център е само нуклеотидът от матрицата, който трябва да се сдвои с новопостъпващия. "Палецът" е друг домен, който не участва пряко в катализата. Той отговаря за високата процесивност на полимеразата, като придържа новосинтезираната молекула ДНК към ензима посредством електростатични взаимодействия. Освен това осигурява и правилното разположение на 3’-ОН края в праймера за катализа.

При синтезата на ДНК към синтезиращата се верига за една секунда се добавят хиляди нуклеотиди и тази голяма скорост се дължи на т.нар. висока процесивност на полимеразата (голямият брой нуклеотиди, които добавя полимеразата преди да се отдели от субстрата). Процесивността е необходимо свойство за синтезата на полимерни молекули. Различните ДНК-полимерази могат да добавят от няколко до 50 000 нт за секунда. Скоростоопределящият етап в синтезата на ДНК е свързването на ензима с молекулата, което отнема около една секунда.

Ролята на "палеца" в осигуряването на висока процесивност се състои в това, че посредством електростатичните взаимодействия не позволява, при временното разрушаване на водородните връзки след всеки каталитичен акт, ДНК да се отдели от ензима.

Характерна особеност на репликацията на ДНК е, че протича с изключителна точност, като една грешка възниква на 10 милиарда нуклеотида. Тази особеност се дължи от една страна на екзонуклеазната активност на ДНК полимеразите, която се състои в отделяне на последния добавен нуклеотид в ДНК, т. е. полимеразата действа в посока 3’>5’, когато изпълнява екзонуклеазна функция. Една на сто хиляди бази може да премине в необичайните имино- и енолни тавтомерни форми, чрез които могат да участват в некомплементарни сдвоявания. В този случай некомплементарните сдвоявания няма да променят съществено параметрите на двойната спирала и не биха се различили в ранните етапи от катализата. След погрешно включения нуклеотид обаче активността на полимеразата рязко спада и полимеризацията се прекратява. Водородните връзки от преишния каталитичен акт са разрушени, но нови не могат да се формират поради неподходящото пространствено разположение на ДНК спрямо "дланта". При така отслабеното взаимодействие между ензима и ДНК, ДНК се отделя от каталитичен център и се премества в екзонуклеазния център, който е върху същата полиепетидна верига. Некомплементарният нуклеотид се хидролизира, ДНК отново се връща в активния център, и полимеризацията продължава. Високата точност на репликацията се постига и чрез пострепликативна репарация (изрязване) на погрешно включените нуклеотиди.

Съществуват множество специализирани ДНК-полимерази. E. coli, нспример, притежава поне пет ДНК-полимерази с различни ензимни свойства, брой субединици и застъпеност в клетката. Основният ензим е  ДНК-полимераза III, която осъществява репликацията на бактериалната хромозома. Тя е част от по-голям комплекс, нар. холоенизм на ДНК-полимераза III. Този ензим се характеризира с най-висока процесивност. ДНК-полимераза I от своя страна отстранява РНК-праймерите, които се синтезират при инициация на синтезата. При E. coli ДНК-полимераза I е полипептид с молекулна маса 109 кД, представен в около 400 копия на клетка. Той притежава 3’>5’ и 5’>3’ екзонуклеазна активност, чрез която разгражда праймерите. ДНК-полимераза I е с ниска процесивност - добавя 20-100 нт, които обаче са достатъчни за изпълнението на функцията й да довършва репликацията на ДНК, тъй като праймерите са къси. Другите три ДНК-полимерази в E. coli участват в репарация на ДНК и не притежават екзонуклеазна активност.

Една еукариотна клетка съдържа повече от 15 видове полимерази. Три от тях са съществени за репликацията на ДНК: ДНК-полимераза δ , ДНК-полимераза ε и ДНК-полимераза α/примаза. Всяка от тях се състои от различен брой субединици. ДНК-полимераза α/примаза участва в инициирането на синтезата. Тя представлява комплекс от четири субединици - две субединици на ДНК-полимераза α и две субединици примаза. Примазата залага праймерите, а ДНК-полимераза αги използва като субстрат за продължаване на синтезата. Комплексът ДНК-полимераза α/примаза има ниска процесивност. Сле като се отдели от ДНК бързо се измества от ДНК-полимерази δ и ε, които са с висока процесивност. Процесът се нарича полимеразно превключване. Останалите полимерази в еукариотните клетки участват предимно в репарацията на ДНК.

В клетките нямат ензими, които да придъединяват нуклеотиди към 5’- краищата на ДНК, т. е. синтезата на ДНК никога не протича в обратната посока от 3’ към 5’- края. Изоставащата верига (тази, която нараства в посока, обратна на продвижването на репликативната вилка) се синтезира под формата на фрагменти на Оказаки. Фрагментите на Оказаки са по-дълги в бактерии, от 1000 до 2000 н. д. В еукариоти тяхната дължина е между 100 и 400 н. д. Водеща верига се синтезира под формата на една нефрагментирана верига. Фрагментите на Оказаки се свързват в интактна верига от ензими, наречени лигази. Те образуват ковалентна връзка между 3’-ОН група и 5’-(α-фосфатна група) в ДНК, каквито групи се откриват в краищата на фрагментите на Оказаки.

Тъй като ДНК-полимеразите не могат да инициират синтезата на ДНК чрез просто присъединяване на нуклеотиди, те се нуждаят от праймер -  къс фрагмент (олигонуклеотид) ДНК (или РНК), към който по-нататък могат да присъединяват нуклеотидите.При репликацията праймерите са къси РНК-фрагменти, което означава че в репликацията на ДНК участие вземат и ензими от типа на ДНК-зависимите РНК-полимерази. Те синтезират едноверижна РНК при матрица ДНК по посока 5’>3’. За разлика от ДНК-полимеразите, те не се нуждаят от зародиши, за да започнат синтезата. Рибонуклеотидите се отстраняват от началото на водещата верига и от фрагментите на Оказаки, преди те да се лигират един с друг, от рибонуклеза Н (РНАза Н), която селективно разгражда само РНК в хибридите ДНК•РНК. Функцията и се допълва от 5’>3’ екзонуклеазната активност на ДНК-полимеразите.

Други белтъци, участващи в репликацията на ДНК, са хеликази, белтъците, свързващи едноверижна ДНК (SSB), примази, топоизомерази и плъзгащите се клеми.

Хеликази

Двете вериги в ДНК са свързани с водородни връзки, които макар и слаби, дисоциират с ниска скорост и разделянето на двете вериги ДНК не може да се осъществи с достатъчна скорост чрез спонтанното дисоцииране на водородните връзки ("дишане" на ДНК). Разрушаването на водородните връзки се извършва от хеликазите. Те обикновено са хексамерни протеини, които се свързват с едноверижнте участъци в ДНК на върха на репликативната вилка като ги обхващат под формата на пръстен. Хеликазите използват енергия от хидролизата на АТФ, за да разделят двете вериги като разрушават водородните връзки между тях. Хеликазите са процесивни енизими, тъй като са способни да разплитат дълги участъци в матричната ДНК, преди да се отделят от нея. При репликацията в E. coli участват две хеликази - DnaB и Rep. DnaB се свързва с матрицата за изоставащата верига и се придвижва в посока 5’>3’, а Rep се свързва с матрицата, направляваща синтезата на водещата верига и се движи в посока 3’>5’.

SSB белтъци

След като хеликазите разделят двете вериги при репликацията за известно време те остават едноверижни, поради което могат обратно да асоциират. Освен това, едноверижните нуклеинови киселини имат тенденцията да образуват двойноверижни структури (участъци от типа “стебло-бримка”), детерминирани от нуклеотидната им последователнст. Повреме на репликацията “оголените” участъци едноверижна ДНК се покриват от SSB-белтъците (Single Strand Binding Proteins), които по този начин възпрепятстват обратното свързване на матричните вериги. Основният SSB-белтък на E. coli е полипептид от 177 аминокиселини и обикновено съществува под формата на тетрамер, който покрива около 32 нуклеотида от ДНК. Свързването на един SSB-тетрамер инициира свързването на други молекули в съседни участъци на ДНК, процес наречен кооперативно свързване. SSB-белтъците се свързват с ДНК посредством електростатични взаимодействия с фосфатния скелет и стекинг взаимодействия с базите, рядко формират водородни връзки с ДНК. Те се отстраняват от ДНК непосредствено след като синтезата на дъщерните вериги достигне до тях.

Примази

Синтезата на дъщерните вериги ДНК при репликацията се инициира от ензим (РНК-полимераза), който синтезира къси рибонуклеотиди, изпълняващи функцията на зародиши, за които се залавят ДНК- полимеразите и продължават синтезата на фрагментите на Оказаки (за изоставащата верига) или на интактната водеща верига. Установено е, че РНК-полимеразата, синтезираща тези РНК-зародиши се различава от останалите РНК-полимерази в клетката, извършващи транскрипцията (синтезата) на РНК връху матрица ДНК. Тези специфични РНК-полимерази, участващи в репликацята се наричат примази. Примазата на Е. coli е единичен полипептид от 60 кДа, присъства в 50 до 100 копия на клетка. Функциите на примазата се състоят в полимеризацията на рибонуклеотидите в РНК-зародиши,  изместване на SSB-белтъците и придвижване по дължината на ДНК-матрицата (за изоставащата верига) по посока на напредване на репликативната вилка, т.е. примозомата се движи в посока, обратна на тази, в която примазата трябва да извършва полимеризацията на рибонуклеотидите в РНК-зародиши. Това може да обясни, защо синтезираните зародиши са много къси – обикновено от 5 до 10 нуклеотида, които всъщност отговарят на дължината на участъка в ДНК-матрицата, покрит от примазата.

В клетките кръговите молекули ДНК се намират в т. н. суперспирализирано състояние. Това важи дори и за линейните молекули ДНК, които в състава на хромозомите никога не са в разгъната (линейна) форма, а определени точки от тях се прикрепват за белтъчния метафазен скелет (или за скелета на интерфазното ядро) и образуват бримки. В този смисъл те също наподобяват кръговите молекули, тъй като краищата на бримките са фиксирани. В природната ДНК (В-форма) двете вериги са дясно-завити една около друга, а двойноспиралната структура се поддържа от водородните връзки между базите. В зависимост от посоката на допълнителното завъртане на двете нишки (усукване или разсуквне) суперспирализацията ще се извърши в едната или в другата посока. Разсукването води до “разхлабване” на двойната спирала и до нейната отрицателна суперспирализация. Допълнителното усукване и стягане на веригата води до положителна суперспирализация. Броят на суперспиралните навивки зависи от броя на разсукванията или усукванията на двете единични вериги една около друга. В този смисъл ДНК може да има една, две и т. н. положителни или отрицателни суперспирални навивки. Различните форми на ДНК, получаващи се в резултат на нейната суперспирализация (с една, две и т. н. суперспрални навивки), се наричат топоизомери, а ДНК която не е суперспирализирана се намира в т. н. релаксирана форма. През по-голямята част от своето съществуване и функциониране в клетката ДНК се намира в отрицателно суперспирализирана форма, т. е. двойната спирала е леко разхлабена, което облекчава нейното функциониране. Суперспирализацията на ДНК в клетката се извършва от специален клас ензими, наречени топоизомерази. Те осъществяват функцията си чрез формирането на временна ковалентна връзка между тирозинов остатък от ензима и единия от краищата на разкъсаната верига ДНК. След съответното завъртане на веригите се осъществява лигиране на разкъсаните краища. Това означава, че топоизомеразите съчетават едновременно свойствата на хидролази (ендонуклеази) и лигази. Наричат се още обратимо действащи рестрикционни ендонуклеази (обратими рестриктази). Тези ензими, които разкъсват само едната от двете вериги в ДНК се наричат тип I (или клас I) топоизомирази.

Топоизомеразите, които осъществяват своята функция чрез въвеждането на двойноверижни (нереципрочни) скъсвания, принадлежат към тип II. В E. coli са открити четири различни топоизомерази. Оптималното (отрицателно) свърхспирално състояние на ДНК в тази бактерия е резултат от съвместното действие основно на два от ензимите – топоизомераза I и топоизомераза II (наречена още гираза). Гиразата е единствената топоизомераза в чревната бактерия, извършваща отрицателна суперспирализация. Нейната активност се контролира от топоизомераза I, която е положително суперспирализиращ ензим (релаксира отрицателни суперспирали) и се активира при прекомерно разсукване на двете вериги. Подобно нещо се случва при транскрипцията, където след РНК-полимреазата матрицата ДНК остава разплетена и топоизомераза I възстановява нейното оптимално свръхспирално състояние. Суерспирализацията на ДНК беше разгледана, тъй като тя създава определен проблем при репликацията. Когато двете вериги се разделят, за да служат като матрици за синтез на дъщерните вериги ДНК, това води до допълнителна положителна свръхспирализация на молекулата. Тъй като изходната форма на ДНК е отрицателна суперспирала, отначало това води до отстраняване на отрицателните навивки, преминаване на ДНК в релаксирана форма, а по-нататък до положителна свръхспирализация и затягане на веригата пред репликативната вилка. Поради тази причина от определен момент нататък ДНК няма да може да се разплита и реплицира. Този проблем в Е. coli се решава от гиразата, която освобождава създалото се положително сврхспирално напрежение.

Останалите две топоизомерази на E. coli, известни като топоизомераза III (тип I ензими, т. е. прави едноверижни скъсвания) и топоизомераза IV (тип II ензим, т. е въвежда двойноверижни скъсвания) решават друг тип топологични проблеми, които възникват при елонгацията и терминацията на репликацията и ще бъдат разгледани по-късно в лекцията. Наименованието на ензимите, което внася известно объркване, просто отразява последователността, в която са били открити четирите топоизомерази на чревната бактерия.

Плъзгащи се пръстеновидни клеми

Процесивността на полимеразите в областта на репликативната вилка се повишава многократно (до хиляди и десетки хиляди пъти) в резултат на свързването им с особен клас белтъци, наречени плъзгащи се клеми. Тези белтъци се състоят от множество идентични субединици, които асоциират в структура с пръстеновидна форма. Клемата обхваща двойната спирала, като остава място за включването на една или две молекули вода между ДНК и белтъка. Пръстеновидните клеми се плъзгат по ДНК без да дисоциират от нея и се свързват здраво с ДНК-полимеразите в областта на репликативните вилки. В отсъствие на клемите ДНК-полимеразата се отделя от матрицата след добавянето на 20-100 нт. Пръстеновидните клеми противодействат на това като следват полимеразата и я връщат в изходанта позиция, така че синтезата на ДНК да не прекъсва. Полимеразите се отделят от клемите при изоставащата верига в края на всеки фрагмент на Оказаки, а при водещата – в края на репликацията на цялата молекула ДНК. Ензимът има висок афинитет към областта, където двойноверижният участък преминава в едноверижен (в края на праймера). При липсата на такъв участък настъпват конформационни промени в ензима, които водят до рязко намляване на неговия афинитет както към двойноверижна ДНК, така и към пръстеновидните клеми. Така в края на репликацията полимеразата се освобождава от ДНК и клемата и е свободна да действа в други области на сдвоени матрица:праймер. От своя страна клемите остават върху ДНК, където се свързват с други белтъци, опериращи върху новосинтезирана ДНК (напр. хистоновите чаперони, белтъците участващи в репарацията на фрагментите на Оказаки). Плъзгащите се клеми са консервативни белтъци. Те функционират при репликацията на ДНК на вируси, бактерии, дрожди и човек. Това обяснява и консервативната структура на тези белтъци. Във всички организми пръстеновидните клми имат формата на правилен шестоъгълник с един и същи диаметър, макар че броят на субединиците може да варира.

Клемите се отварят и поставят върху ДНК от белтъчни комплекси, наречени "товарачи" (γ-комплекс в E. coli) . За целта се изразходва енергия от хидролизата на АТФ. Същите товарачи махат клемите от ДНК в края на синтезата. Клемите се качват винаги, когато в ДНК има сдвояване матрица:праймер или иначе казано частично двойноверижна ДНК, каквато се образува и при репарацията на ДНК. Клемите се махат от ДНК само ако не са в асоциация с други белтъци, т. е. ако достатъчно дълго не участват в други процеси. Това става възможно тъй като "товарачите" и останалите белтъци (ДНК-полимераза, хистонови чаперони, репариращи белтъци и др.) се конкурират за свързване с една и съща област в клемите. В областта на репликативната вилка водещата и изоставащата верига се синтезират едновременно. По този начин значително се съкращава времето, през което в ДНК съществуват оголени едноверижни участъци. Това е важно, тъй като последните са по- уязвими, по-лесно мутират и по-трудно се репарират.

Xолоензим на ДНК-полимераза III

Координираната репликация на двете вриги в ДНК се осъществява от едновременното действие на няколко полимерази. В E.coli тази координация се улеснява от свързването на тези полимерази в голям белтъчен комплекс, наречен холоензим на ДНК-полимераза III. Холоензимът включва две копия на полимеризиращата субединица (сърцевинен ензим) и едно копие товарач на плъзгащи се клеми, състоящ се от пет субединици (γ-комплекс). Товарачът е в едно копие, но се свързва и с двете полимеразни субединици и е съществен за формирането на холоенизма.

Тромбонен модел

видео

След като хеликазата раздели двете вериги ДНК, водещата се реплицира веднага, а изоставащата образува едноверижно ласо, което бързо се покрива от SSB-белтъци. Веднага в основата на вилката (т. е. близо до все още неразделените вериги ДНК) върху ласото се синтезира нов РНК-праймер. Полимеразната субединица, оперираща върху изоставащата верига, след като довърши синтезата на предишния фрагмент на Оказаки, се отделя от пръстеновидната клема и ДНК. Тя обаче е асоциирана с останалите субединици на холоензима и бързо се притегля обратно в основата на репликативната вилка. През това време хеликазата освобождава нов еденоверижен участък, а товарачът от състава на холоензимна качва нова клема върху вече заложения РНК-праймер, с която асоциира и полимеразата на изоставащата верига. При целия този процес се изтегля ново едноверижно 'ласо' и описаните събития се повтарят. Описаният модел се нарича тромбонен поради променящата се големина на едноверижното "ласо" формирано от изоставащата верига. 

При еукариоти при всяка репликативна вилка оперират три различни ДНК- полимерази: ДНК Pol α/примаза, ДНК Pol δ и ДНК Pol ε. ДНК Pol α/примазата инициират синтезата на нови вериги, а ДНК Pol δ и ДНК Pol ε удължават тези вериги. Има данни, че ДНК Pol δ и ДНК Pol ε извършват синтез в противоположни посоки.

Репликативната вилка в E.coli напредва бързо благодарение на взаимодействията между субединиците в рамките на холоензима на ДНК-полимераза III. Важно зна1чение има и взаимодействието между хеликазата и холоензима. Това взаимодействие се опосредства от товарача на клеми и благодарение на него скоростта на придвижване на хеликазата по ДНК нараства десет пъти. Ако хеликазата се отдели от холоензима, тя се забавя, с което се избягва денатурирането на ДНК в отсъствието на репликация. Друго важно белтък-белтъчно взаимодействие е това между хеликазата и примазата. За разлика от повечето белтъци, опериращи в областта на репликативната вилка на E. coli, примазата не е така здраво свързана. На интервали от по една секунда примазата се свързва с хеликазата и едноверижната ДНК, покрита от SSB-белтъци и синтезира нов РНК-праймер. Макар че взаимодействието между хеликазата и примазата е сравнително слабо, това взаимодействие значително стимулира примазната функция (приблизително 1000 пъти). След синтезата на праймера примазата се отделя от хеликазата в цитозола. Слабите взаимодействия между примазата и хеликазата регулират и дължината на фрагментите на Оказаки. При по-силни взаимодействия се извършва по-честа синтеза на праймери и респ. фрагментите на Оказаки са по-къси. Комплексът от всички белтъци в областта на репликативната вилка се нарича реплизома.

Инициация на репликацията

Началата на репликация са местата, където се инициира образуването на репликативните вилки. Прокариотните геноми (бактериални и фагови) обикновено имат едно такова начало. Инициацията на репликацията е сложен процес, в който участват редица белтъчни фактори (trans-фактори). Те влизат в сложни взаимодействия помежду си и с cis-факторите от репликатора. Репликаторът на E. coli e изолиран и секвениран. Toй се състои от 245 нуклеотиднии двойки и е разположен между гена за аспарагинсинтаза (аsn) и оперона, който контролира синтезата на мембранно свързаната АТФ-синтаза (atp). Не вскички нуклеотиди от тези 245 са съществени за функционирането на репликатора. Най-съществени за репликацията са само онези участъци, които се разпознават от специфичните белтъци, необходими за инициацията на репликативната вилка. Един такъв белтък е инициаторът на E. coli, продукт на гена dnaA. Този белтък (DnaA) се свързва с четири консервативни последователности в репликатора, състоящи се от по 9 н. д.

tgtggata ttatacaca tttggataa ttatccaca

В непосредствена близост с 9-мерните повтори се намират три 13-мерни повтора, които са богати на А:Т и в които става разделянето на двете вериги. По дефиниция това е самото начало на репликация (ori). Функцията на DnaA- белтъка се регулира от АТФ. Само когато е свързан с АТФ (но не с АДФ), DnaA-белтъкът взаимодейства с ДНК от областта на 13-мерните повтори в репликатора. Тези взаимодействия водят до разделяне на двете вериги в ДНК по протежението на повече от 20 н. д. Тази денатурирана ДНК осигурява едноверижна матрица за другите белтъци участващи в реликацията да започнат стъпките на синтеза на РНК и ДНК.

Образуването на едноверижна ДНК на дадено място в хромозомата само по-себе си не е достатъчно за свързването на хеликазата и останалите белтъци от състава на реплизомите. За тази цел е необходимо присъствието на белтъка DnaA. Така този белтък разпознава началото на репликация като се свързва с 9-мерните повтори, стимулира разделянето на двете вериги в ДНК и взаимодейства с останалите белтци, участващи в инициацията. Регулацията на репликацията в E. coli е тясно свързана с контролиране активността на DnaA-белтъка.

Репликацията на ДНК и деленето на бактериалната клетка са координирани, така че всяка дъщерна клетка да получава по едно пълноразмерно копие от единствената хромозома. Това означава, че съществуват механизми за блокиране на повторна инициация на репликацията след като тя вече е започнала. Механизми за блокиране на ре-инициацията на репликацията в E. coli Един от тези механизми е свързан с нивото на метилиране на ДНК преди и след нейната репликация. Ензимът Dam-метилтрансфераза е място-специфичен ензим, който метилира аденина във всяка тетрамерна последователност GATC. Обикновено всички такива места в генома са метилирани. Това състояние се променя след репликацията, тъй като в едната верига (новосинтезираната) на ДНК адениновите остатъци са неметилирани. Такава ДНК се нарича хемиметилирана (полуметилирана). Хемиметилираното състояние на новореплицираното ori се разпознава от белтък, наречен SeqA. Този белтък се свързва здраво с последователността GATC, но само когато тя е хемиметилирана. Не случайно в непосредствено съседство с ori ДНК е богата на такива тетрамерни последователности. Веднага след инициацията на репликацията SeqA се свързва с последователностите GATC, преди те да се метилират от Dam-метилтрансферазата. Последствията от свързването на SeqA са две. Първо, драстично се понижава скоростта, с която се метилира аденина в последователностите GATC. Второ, възпрепятства се повторното свързване на DnaA с репликатора и ре-инициацията на репликацията.

Съществува и друг механизъм за блокиране на бързата ре-инициация на репликацията на новосинтезираните дъщерни молекули ДНК. DnaA-белтъкът може да инициира репликацията, само когато е свързан с АТФ. Този АТФ обаче хидролизира бързо до АДФ повреме на инициацията, което води до инактивиране на DnaA-белтъка и до невъзможност за неговото непосредствено използване. Процесът на рециклиране на DnaA е бавен, което допълнително възпрепятства повторната инициация на репликацията.

Освен инициатор на репликацията, DnaA- белтъкът е регулатор на транскрипцията от редица промотори и по тази причина в генома на E. coli се срещат около 300 9-мерни повтора като тези в репликатора, чиито брой се удвоява след репликацията. Свързването с тези последователности допълнително редуцира количеството DnaA-белтък достъпно за ре-инициация на репликацията. Процесът на инициация се контролира от белтък-белтъчни и ДНК-белтъчни взаимодействия След свързването на инициаторния белтък с началото за репликация, всички останали стъпки в инициацията на репликацията се регулират основно от блетък-блетъчни и ДНК- белтъчни взаимодействия, които са независими от нуклеотидната последователност в ДНК. Крайният резултат от инициацията е образуването на двете репликативни вилки.

Най-добре изучени са събитията при инициацията на репликацията в E.coli. След свързването на инициатора DnaA с репликатора и разделянето на двете ДНК- вериги в ori С в областта на 13-мерните повтори, едноверижният участък (но само в присъствието на DnaA) свързва два белтъка: хеликазата (DnaВ) и товарач на хеликази (DnaС). В образуващия се белтъчен комплекс и хеликазата и товарачът представляват хексамерни белтъци. В този комплекс хеликазата се поддържа в неактивно състояние. След като се свърже с едноверижната ДНК в oriС товарачът качва по един хексамерен хеликазен пръстен върху двата едноверижни участъка в процес, който много наподобява качването на плъзгащите се клеми от техния товарач около сдвоените матрица:праймер. След това товарачът се отделя от комплекса и двете хеликази започват да разплитат ДНК, движейки се в противоположни посоки по двете матрични вериги с полярност 5’>3’ (т. е. по веригите, които са матрици за синтезата на изоставащите вериги).

Хеликазата след това привлича примазата, която залага по един РНК-праймер върху двата едноверижни участъка в ori. Два холоензима на ДНК-полимераза III се присъединяват към ori като взаимодействат с двете места на сдвояването матрица:праймер. След това товарачът на клеми (който е елемент от холоензима) качва плъзгащите се клеми около РНК-праймерите и полимеразните субединици върху водещите вериги се активират. През това време хеликазите вече са освободили достатъчно едноверижно"ласо" в матриците за изоставащите вериги, което се покрива от SSB-белтъци и примазите синтезират първите РНК-праймери за синтезата на двете изоставащи вериги. Около новите праймери се качват клеми (от холоензимния товарач), които се разпознават от другите полимеразни субединици в състава на холоенизмите – тези синтезиращи изоставащите вериги. Това води до окончателното формиране на двете репликативни вилки с техните реплизоми, което се определя и като завършване на инициацията на репликацията.

Не са открити специфични последователности в ДНК, необходими за терминация на репликацията.

В E. coli гиразата изисква определена степен на свръхспирално напрежение, за да релаксира ДНК. Поради това в крайните етапи на репликацията тя не може да продължи разплитането на двете вериги и тук се намесва топизомераза IV (тип II топоизомераза). При мутации в гена, кодиращ този ензим недореплицираните кръгови молекули се изполират под формата на т. н. катенани. Установено е обаче, че мутации и в гена за топоизомераза III (тип I топоизомераза) имат същия ефект, т. е. водят до формирането на катенани при репликацията на кръгови молекули ДНК. Функцията на този ензим се изявява основно повреме на елонгацията на репликацията. На този етап съществуват възможности за преплитане на новосинтезираните дъщерни молекули, най-вече поради фрагментиранта синтеза на изоставащата верига. При подобно преплитане на дъщерните веригие се формират т. н. прекатенани, структури, които ако не се отстранят по време на елонгацията ще имат същия краен ефект – формиране на катенани. Топоизомерази III и IV в E. coli изпълняват основно декатенираща функция повреме на репликацията.

Терминация на репликацията на линейни молекули ДНК

Необходимостта от РНК-праймер за синтезата на ДНК създава определен проблем при репликацията на линейните хромозоми. Този проблем възниква само при синтезата на изоставащата верига. При водещата верига удължаването на РНК-праймера може да продължи до самия край на молекулата. Дори ако краят на последния РНК-праймер за синтезата на изоставащата верига се сдвоява точно с последната база на матрицата, то след неговото отстраняване ще остане малка недореплицирана едноверижна област в края на хромозомата. Това е така, тъй като няма полимераза, която да синтезира ДНК в посока 3’>5’, която е единствената възможна посока за довършване синтезта на изоставащата верига. Клетките разрешават този проблем по различни начини.

Теломерази

В повечето еукариотни клетки съществува механизъм за репликация на краищата в хромозомите (теломерите). Тези области се състоят от много прави повтори на TG-богата последователност. Напр., човешките теломери се състоят от много прави повтори на последователността 5'-TTAGGG-3’. 3'-краят на всяка хромозома стърчи над 5'-края като едноверижно удължение. Този стърчащ край е начало за репликация за специализирана ДНК-полимераза, наречена теломераза. Този ензим включва белтъчен и РНК компонент, т. е. е рибонуклеопротеин. Подобно на всички ДНК-полимерази, теломеразата удължава 3'-ОН край в ДНК, но не се нуждае от външна ДНК матрица, за да катализира добавянето на нови нуклеотиди, тъй като сама си я осигурява. Тази матрица е РНК-компонента на ензима, който съдържа 1.5 копия от последователност, комплементарна на теломерните повтори (при човека тази последоватеолност е 5'- ТААСССТАА-3'). Тази област от РНК може да се сдвои с едноверижната ДНК в 3'-края на теломера. Сдвояването се извършва така, че част от РНК-матрицата остава едноверижна и се създава участък матрица:праймер със свободен 3'-ОН край в ДНК, където може да действа теломеразата.

Полимеразният компонен на теломеразата е сходен с този на РНК-зависими ДНК-полимерази, нар. обратни транскриптази. Теломеразата синтезира ДНК до края на РНК-матрицата, но не може да продължи да копира РНК след тази точка. Ето защо РНК-матрицата се отделя от ДНК-продукта, отново се сдвоява с последните три нуклеотида на теломера и процесът се повтаря. Теломеразата има РНК•ДНК-хеликазна активност, чрез която измества РНК- матрицата от ДНК-продукта в повтарящите се цикли на синтеза.

Когато теломеразата действа в 3'-края на теломера, тя само удължава този край в хромозомата. От друга страна удължаването на  5'-края се извършва от апарата, който синтезира изоставащата верига. В новосинтезирания едноверижен участък се залага фрагмент на Оказаки и синтезата протича по известния вече начин. В крайна сметка в края на репликацията отново остава къс едноверижен участък в края на теломера. Смисълът обаче е теломерите да остават достатъчно дълги, за да не се стигне до делетиране и увреждане на важни гени. Клетката регулира броя на теломерните повтори, но не строго, т. е. толерират се вариации в определени граници. 200-400 повтора в теломера са достатъчни, за да го предпазват от рекомбинация и деградация.

 

Използвана литература:

1.      Lehninger principles of biochemistry (4th ed.): Nelson, D., and Cox, M.

2.      Molecular Cell Biology (8th ed): Lodish et.al.

3.      Molecular Biology Of The Cell (4th ed): Alberts B. et.al.

4.      Genes VIII: AND Molecular Biology of the Gene: Lewin B. et.al.

5.      https://www.znam.bg

6.      https://www.wikipedia.org

 

 

Добавете коментар

Защитен код
Обнови